边界名词2018年10月23日

saxenaa、DagurPK、DesaiA和McCoyJP

前端2018年10月23日Imunol

DOI: https://doi.org/10.3389/fimmu.2018.02462

研究中我们展示直接量化测量单人CD8淋巴细胞内细胞蛋白的可行性exvi启发性Cytokine保密细胞使用细胞表面捕捉试剂识别,单细胞数据通过整理单细胞保密细胞编成96口井板获取,内含解析缓冲,后再用超敏感免疫测定法分析干扰伽马和肿瘤死因数alaCD8阴性细胞生成,由细胞表面抓取试剂判定为负控件此外,还进行了研究,比较流体细胞染色素平均密度值和用当前方法量化细胞涂色值这项研究显示,从单个初级细胞量化细胞实战是可行的从质向量测定单细胞内细胞蛋白质水平将允许对免疫系统异性进行更精确和可复制研究,并可用现成工具实现。

导 言

细胞群中细胞异质感的提高激发单细胞分析技术(1,2)使用流和质量细胞测量技术(3,4)观察出这种异质性,然而单细胞分离研究从异族群中主要涉及基因组学和定型学方法与蛋白质异异性相关数据极有限,特别是蛋白质量化数据极有限。大部分用于研究细胞蛋白的免疫学学,如ELISA、Luminex珠数组和Western染色体,对像图至高ml范围敏感,这些敏感度太弱,无法检测和量化单细胞蛋白,因此需要对大数细胞量化解析物,这些细胞被认为同质性传统方法易获取简单,但可错误描述样本单细胞行为分布这一点很重要,因为即使是基因相同的细胞也是动态的,并因子形差异、细胞内信号的随机性质和小数点所作用的分子(5,6)而在响应刺激方面各异极能检测单细胞蛋白质的技术,如流质细胞测量技术,不收集精确量化蛋白量的数据,而是描述相对蛋白水平为bright或dim

研究单细胞迄今一直是一个挑战,并限制研究细胞功能在疾病发病和自闭症期间发生关键变化多单细胞研究测量 mRNA替代蛋白类7 8此类研究的结果常辩论,并显示MRNA剂量量与表示蛋白质量无关(9,10)。因此,更重要的是在单细胞层次描述蛋白表达式曾研究单细胞级细胞蛋白质量化报告(11-14)。数类定制设备非商业可用性(11 12)。另一些则需要引入荧光蛋白质报告器或含氟子串实现单细胞蛋白量化SiMoA-新奇超敏感免疫学学最近作为一种商业产品(15,16)引进使用数组femtoliter响应室新技术Simoa(SingleMolecule数组)帮助测量方位富集式各种介质中的蛋白质不同于ELISA(Enzyme关联免疫感应测试)类比系统SiMoA不需要大容量稀释响应产品数组量约20亿比传统ELISA小20亿倍因此,如果贴有标签的蛋白质存在,可生成快速编集荧光产品最近的一项研究使用Simoa技术检测croducedLNCaP细胞线中前列腺抗原(PSA)表示不同量PSA(17)。研究可检测从高低PSA表达式细胞线分离出的单细胞之间的可量化PSA值差并报告每个细胞测量PSA分子数可惜本研究没有将PSA负细胞检验为实负控件并检验细胞线增长试管内而不是主细胞

免疫细胞群异性允许灵活性,特别是在动态过程期间,如分化和抗原响应,研究异性是一项挑战,单细胞分析有效解决(18,19)。ytokines开发T子集功能异微小蛋白对细胞信号、效果函数和通信都很重要单细胞级量化这些蛋白质,有助于更好地了解细胞路径和行为,使用绝对比相对测量法

基于可用技术稀疏使用现成仪表量化单细胞中特定蛋白量,并基于使用SiMoAPSA大有希望研究,我们试图确定是否可以对技术进行适配以量化淋巴细胞内细胞素超敏感量化大型亲炎细胞像TNF-A和IFN-GM

材料方法

图1显示本研究工作流总体图

健康捐助者

人体外围血单核细胞收集自国家卫生院临床中心健康捐赠者样本经机构审查局批准后采集并签署捐赠者书面知情同意书(协议07-H-0113)。

试剂

yabo2018客户端Simoa HD-1分析器、Simoa消耗品和IFN-GMIF-FNG-GLG-138Kit和TNF-ATSIMTTNF-DUT2.0208KitFNF-GL和TNF-A检测包从MitenyiBiote技术公司Auburn公司购买反人类CD8(BV605克隆SK1)取自BD生物科学与Live/Dad可修复AquaRPMI-1640(Grand Island ThemFisherGibco)补充10%FCSFACS染色缓冲法(XPBS,0.5%牛血清相册,0.025mEDTA)用于FACS染色透析缓冲区由解析缓冲17和HaltTMProtise Inhibtior鸡尾酒组成(ThemFish科学,RockfordIL)。

细胞文化促销

所有样本均在24h内处理整滴血重新悬浮在ACK解析缓冲中(质量生物学,Gaitersburg和MD),并分2-3分钟在室温下孵化到LyseRBC再用离差法冲刷PBSPBMC生成率和可行性使用Trepan蓝染组测定,细胞计数用电容计法执行

Iftn-CPA和Tnf-AL捕获分析使用抓取反体

FNF-G和TNF-A-使用分解测试包检测出密室AuburnCA)根据制造商指令简言之,2-3x106PBMC用Phorbol12mystate13西格玛-阿尔德里奇Louis,MO)和iomiccinLouis,MO)3h37摄氏5%CO2手机曾用冷盘冲刷细胞粒子悬浮80微l冷介质和20微lIFN-GM或TNF-AL抓取试剂(反CD45和IFN-G或TNF-AL双专用反试剂)。4摄氏10分后添加1毫升热介质细胞定位为37摄氏度 慢旋转平台 允许细胞分解45分立即放入冰层并用冷缓冲区冲刷(300g、10m、4oC)并再悬80ml冷缓冲区隐式IFN-GAN试剂与20mlPE相容IFN-GAN或TNF-AT专用反体摄取周期为4摄氏度时10分后,细胞用冷缓冲区冲刷、滑动(300g、10m、4oC)并重新悬置FAS缓冲细胞染色表示面标CD8和Live/Diad可修复Aqua

Tnf-A捕获应用Tnf-A处理Inhibitor

PBMC恢复使用RPMI106细胞/ml,在使用前消毒过滤细胞用PMA刺激10纳克/毫升sigma-Aldrichi)iomiccin(500纳克/mlSigma-Altrich)15微升反TNF-ffaPE(BD生物科学)和10微米TAPI-0(Calbiochem,Burlington,MA)3h编程反TNF-ffatPEmAb后,细胞在随后的任何步骤中均不与反TNF-ffa重染孵化后细胞染上表层标志CD8和Live/Diad可修复Aqua(Life技术,Grand Island,NY)。

单元格排序

染色细胞分类为CD8+sIFN-Q-Bright和CD8+sIFN-Q-NG-NETER或CD8+sTNF-ALBRET和CD8+sTNF-A+yabo2018客户端单片单片分解96井V底板(QuanteixCorporation),内含25ul解析缓冲17(R&DSystem)和HaltTMProtise inhibtor鸡尾酒(them Fisher科学,RockfordIL)。FACSAriaSORPTM排序器配有355、405、488、532和638纳米激光线和DIVATM8.0.1软件验证单CD8+单元格每井均存性时,我们执行了一些附加类型CFSE(0.5um)(俄勒冈州Invitrogen)染色CD8+T细胞排序成96井底板50微lRPMI-1640(Grand Island ThemFisherGibco)(CostrCorning Inc.NY)。单片井用NikeneclipseTS100反向显微镜观察计算(Melville,NY)。2板以这种方式排序(192井),我们发现190口井包含1个单元,2口井不包含细胞,0口槽包含2个或2个以上单元,结果单细胞精确沉降99%

simoa检验程序

IFN-GAR和TNF-AL测试包标准曲线调整处理单细胞测试较低集中范围问题制造商协议定义标准曲线修改为单单元IFN-GAR检验上三标准曲线分数并下端引入三大曲线分数TNF-A+2标准曲线点并增二分曲线下端样本稀释度增加解析缓冲17(研发系统)和SiMoA测试包样本稀释度三重稀释样本测量加插IFN-NF-G和TNF-AL蛋白对每次运行都定出标定曲线,并判定浓度和采样稀释CV%功率曲线适配集中图(x-axis)CV%(yaxis),LLOQ最低集中度为++20%CV(补充图1AB)计算法解决功率方程

单分子数组分析

yabo2018客户端单片单片单元收集96口五底板(QuanteixCorporation),内含25ul解析缓冲17(R&D系统),如上所述电池终于稀释成110微升样本稀释物SiMoA工具箱提供,以获取总样本量135微升/单单元所有细胞样本和解析试剂(抓取珠子、检测反体、SBG和RGP)都装入HD-1分析器的适当试管平均单珠数计算基于活动水井数和珠子总数,使用Poisson统计和前文描述数字或模拟方法(20)。FNF-G和TNF-AL细胞标定曲线适配四参数逻辑加权回归单细胞数乘Avogadro常量乘模数摩尔数计算法取IFN-GM或TNF-ALggm分量取IFN-GET或TNF-ALT分子量取IFNF-GET和TNF-ALT下限量化值IFN-GM和TNF-A和TNF-a-0.0028pg/mlLLOQ使用Andreasson等(21)

Iftn-GAN竞争反射解析

CD8+IFN-NQPMA促销正负细胞分类96口井中,5至10个电池/水井(sIFN-GANspos和neg)分解成10口水井复制件,内含25微升解析缓冲17电池终于稀释成110微升解析SiMoA工具箱提供总样本体积135微升/井单片96平面底板上涂有反人IFN-GA反体(Clone-MD-1-Biole反人类IFN-GM反体封套4摄氏度4摄氏度稀释液晶体与控制板完全相同,用IFN-Q反体封装板45分钟后转至SiMoA板作最后读出yabo2018客户端重构人IFN-GM蛋白盒(SiMoATMIFN-GNAL138Kit)用于仿真抑制实验

统计学

细胞阳性细胞和负性细胞比较使用单向ANOVA和Dunnett多项测试后比较spearman关联测试 sIFN-QMFI值和手机IFN-GAN抑制分析结果应用Mann-Whitney测试分析所有分析均使用GreaphPad Prism软件进行(版本7.0,GreaphPad软件,美国圣地亚哥)。意义层次定在公元前< 0.05.统计分析中,LLOQ下值分配LLOQ值

结果

ytokine抓取解析

使用非入侵细胞采集技术识别IFN-GM和TNF-ACD8 T细胞常导致CD4大规模下调(2223),而CD8细胞表达方式只略受影响(24)。单克隆抗体附合CD45单克隆抗体(mouseIgG2a)并附于上文描述的所有多克隆Leukocytes细胞表面细胞再冲去任何过量抗体,再与PE并发IFN-GM或TNF-AL反体分析并用流细胞测量法分析我们的目标是检验单细胞集中度IFN-GAR或TNF-A和数组内聚度依次数序-1、2、5和10从sIFN-Plight和sIFN-Q-Neg或TNF-Abright和TNF-Neg编成96井板(图2AB)。单细胞数排序,每个板有10次复制 实验重复三次

TNF-AL生产CD8+T-ymphytes还用另一种方法评价,即使用TNF-AL处理抑制器捕获隐式TNF-AL简言之,TNF-Affa从细胞表面释放以通过TACE活动成为可溶TNF-A荧光共聚反TNF-AL反体文化与这个表层TNF-A并发,有助于检测细胞主动隐蔽细胞2C图2C

单Cd8TellsIfn-Net量化

SiMoA用单CD8T细胞量化IFN-GM135微微微微微微微微微微微微微微微微微微微微微微微微微微微微微微微微微微微微数估计取自从光和二门IFN-GAN生成细胞中收集的单细胞,取自检测通道中的荧光强度

图3A显示标准曲线IFN-GAN3天实验并显示SiMoA剖析可复制性单排序时,CD8+T单元显示平均6.22fgIFN-GN级=27)CD8T单元中每单元FN-GAN平均显示相似结果,对1、2、5或10个单元分别排序(6.22、6.20、5.93和5.44fg/cell)(分别为6.22、6.20、5.93和5.44fg/cell)(N级= 27)所有测量总平均值为5.95fgIFN-GM-GM/SD=0.363,相对SD=6.11%(图3B),等于185 102分子以测试单细胞前用IFN-GM抗体解析发现IFN-FAN抗体先入水井与无处理水井相比严重抑制IFN-GAN水平(图3C)。这些数据显示Simoa敏感度足以量化单片细胞IFN-GAN,因为多单片细胞增量(并因此多IFN-GAN/单片细胞增量)不严重影响平均细胞量化细胞表IFN-GAN透露数量低于IFN-GANLOQ

单CD8T槽内Tnf-A

进行了类似实验研究TNF-DA生成CD8+T细胞TNF-A标准曲线显示SiMoA解析可复制性(图4A)。反TNF-Da捕获试剂和TAPI-0检测细胞分解方法都产生类似结果(图4B)。TNF-AL生成CD8+T单片显示平均为2.49fgTNF-ALN级= 30)(SD= 1.23),同时对1、2、5和10细胞逐井计算值为2.49、1.59、1.30和1.16fg/cell,整体平均所有测量值为1.64fgTNF-AN级= 30)(图4C)等值38 467分子TNF-ffa负细胞显示0.6fg/cells平均值(SD=0.47)(N级=30)

Simoa解析中值荧光密度与蛋白浓度比较

我们进一步质询使用SiMoA量化蛋白浓度是否与流细胞测量所观察的细胞素平均荧光强度相匹配MFI常用流细胞测量表示分子平均相对量,由特定信道中荧光检测实验用10个细胞对每井排序MFI值超过12500强正相关公元前<0.0001;R2 = 0.97在定性MFI测量值和IFN-GAN量化值CD8T细胞间检测到SiMoA值(图5AB)。

荧光强度信道数

讨论

单细胞剖析成为研究细胞异性的一个重要工具在这次研究中,我们报告单CD8T细胞中超敏感检测亲炎细胞IFN-NF-NF-NF-NF-NF-TNF-DL使用流细胞排序和自动Simoa平台,我们演示单人初级细胞的蛋白量化法,这些单人初级细胞可轻易实现而无需多分解分解分解法、定制微流化法或复杂建模法

测定单细胞量化蛋白量的研究迄今有限Roderoetal(26)最近的一项量化IFN-Aex-viCD8T细胞发现约14fg/cell研究中收集的细胞大池CD8分类数(~5万至10万个细胞)并计算出每个细胞的相应值Rodero报告此细胞的单位值时,没有进行真正的单细胞分析,因此值表示所有值的平均值,可能不反映所研究的整个样本异性另一项研究Shubert等人对单细胞进行蛋白估计17报告前列腺特殊抗原量化单列前列腺癌细胞研究由串行稀释细胞实现单细胞,尽管单细胞收集没有验证此外,该研究检验一行细胞,而不是初级细胞Ma和同事用编造微芯片研究分析单细胞多路解析法(27)。当前研究与马氏研究在两个重要方面不同:(1)maetal测量隐式解析法而当前研究中我们量化细胞内解析法使用定制仿微流化芯片分析单细胞,而当前研究仅使用商业可用设备,在大型研究中心常见虽然这些研究大相径庭,但我们认为这两个研究互为补充,为单细胞学习提供不同渠道

使用简单单克隆反细胞素或TNF-AL使用酶抑制器来阻截显性细胞生成细胞表面释放SimoA数据量化单细胞TNF-A有趣的是,这些分析为单细胞级TNF-A浓度得出相似结果,确认这些分析的强健性并验证单细胞观察到的蛋白浓度假设,如果使用细胞表层制造器或四倍绑定可识别出具体的细胞生成器,则有可能使用这些标记对单元格排序并用当前方法使用对当前研究有警告第一,当我们直接对细胞分解缓冲时,我们无法直接验证每井只有一个细胞分解独立实验中,清新人类PBMC标签为carboxyfluesinsucnidyle因此我们认为相似精度适用于实验数据第二项警告是,为细胞移植负样本获取的值处于我们标准曲线极低端,基本为低量化水平,因此这些值的精度有问题单细胞级量化蛋白质能力开启了许多令人振奋应用流细胞测量法极能检测低水平蛋白质,如细胞素算法不真正量化取结果报告为bright或dim或充其量为相对荧光索引将当前方法应用到这些研究中将允许精确量化并可能有助于大范围规范诸如检验等因为我们的解析直接量化细胞内解析物,而不是mRNA,它提供一种可能更为相关的生物测量物,而没有任何偏差通过酶放大可研究单细胞层次的分子机制、路径和细胞异性,以便有可能实现疾病早期检测或目标治疗响应同时,该技术在蛋白质量化方面效率高,疾病条件中细胞数限制研究效果器函数总结当前工作描述精密敏感强健可用单细胞蛋白分子量化系统技术为单细胞分析领域提供一个重要的新工具